H. Pylori: studio comparativo tra metodiche diagnostiche e loro attendibilità

HELICOBACTER PYLORI: studio comparativo tra metodiche diagnostiche e loro attendibilità.
G. Bardellini; A, Villella


Si calcola che attualmente l’80% della popolazione mondiale sia venuta a contatto, almeno una volta nella vita, con l’ H. Pylori (HP), batterio microaerofilo gram -, munito di 4-6 flagelli, ricurvo o spiraliforme, isolato per la prima volta da Marshall e Goodwin nel 1987 dalla mucosa gastrica dei primati. La diffusione diretta interumana dell'infezione da HP può essere oro-orale e oro-fecale. La diffusione oro-orale è rappresentata dalla presenza nella mucosa gastrica dell'HP; il reflusso gastrico può raggiungere la cavità orale ed in particolare la placca dentaria e da qui con la saliva essere il veicolo di trasmissione. La diffusione oro-fecale è sostenuta dal continuo turnover della mucosa gastrica: la ripetuta eliminazione nell'intestino dell'HP proveniente dal succo gastrico e la capacità di sopravvivenza dell'HP nelle feci, da dove è eliminato nell'ambiente, rende l'acqua e il cibo contaminabili.

L'infezione da HP è stata associata con importanti disordini linfoproliferativi quali il linfoma gastrico non-Hodgkin(7), il MALT (Tessuto Linfoide Associato alla Mucosa gastrica)(1) ed il Carcinoma gastrico.(5)(4)(3)(2) Nel 92% dei campioni ottenuti da pazienti con linfoma gastrico, è stata accertata la presenza di HP.
L’interesse suscitato nel mondo medico dall’infezione da HP ha portato inoltre a postulare un suo ruolo in svariate altre patologie extra intestinali (6)(8)(10)(11), anche se al momento attuale viene accettata una sua relazione solo con la porpora trombocitopenica e con l’anemia sideropenica. (9)(10)(12)
La rilevanza epidemiologica e clinica delle patologie associate spiega l’ampio sviluppo di metodiche diagnostiche proposte per la sua identificazione, distinte in due grandi gruppi: invasive e non invasive.



METODICHE INVASIVE: Esofago-gastro-duodenoscopia (EGDS)

Istologia

Il riscontro della presenza di HP nel materiale bioptico è stato il primo criterio diagnostico. L’identificazione con la normale colorazione ematossilina eosina risulta agevolata con altre colorazioni, quali il Giemsa.
La non uniforme distribuzione del batterio sulle superfici gastriche richiede tuttavia, per un adeguato giudizio, che siano eseguite varie biopsie, con un minimo di due in sede antrale e due in sede di corpo – fondo.
Bisogna tener presente che la gastrite atrofica e la metaplasia
intestinale, che rendono meno facile la crescita dell’HP, riducono la densità dei batteri e ne modificano la distribuzione, fatto che determina la necessità di una ulteriore attenzione nella mappatura bioptica.
Anche il trattamento con inibitori della pompa protonica(PPI) causa una diminuzione della sensibilità di tale metodica, rendendo impossibile l’identificazione del batterio in circa un terzo dei casi.

Test all’ureasi

L’HP possiede una elevata attività ureasica, con conseguente
produzione di NH3 che produce un cambiamento del pH nel medium, rilevabile dal cambiamento di colore dell’indicatore acido-base (il più usato è il rosso fenolo). Questo ha portato alla sviluppo di alcuni
test che utilizzano vari sistemi di rivelazione del cambiamento di pH a diversi tempi di reazione. La sensibilità di tali metodiche, paragonate all’identificazione istologica, si pone poco al di sotto del 90% ed ha trovato ampio uso nelle sale endoscopiche.
Per i limiti della metodica, va sottolineato lo stesso problema riportato per la biopsia, legato alla distribuzione del batterio e all’eventuale uso di PPI.



Coltura

La relativa complessità e i costi superiori di questa metodica la rendono indicata solamente nei casi di ripetuti insuccessi della terapia eradicante in cui l’isolamento del batterio consente di saggiarne la sensibilità ai diversi antibiotici, per una terapia mirata. Va tenuta
primitivamente presente l’importanza di una corretta conservazione del campione in quanto l’HP può resistere per 24 ore in terreno di Stuart se conservato a 4°C, mentre la conservazione a temperature più elevate, anche solo 15°C, ne rende la vitalità assai bassa.
Esistono in letteratura dati ricavati dall’isolamento e coltura dei batteri in materiale diverso dalla mucosa gastrica (es. placca dentaria e feci) ma il cui significato e utilità rimangono dubbi. Questa metodica, che teoricamente ha una sensibilità del 100%, è tuttavia molto
influenzata dall’esperienza del singolo laboratorio microbiologico.
Un altro possibile vantaggio teorico di un accurato studio microbiologico consiste nella possibilità di distinguere i vari ceppi, con particolare riguardo al tipo I che esprime il fenotipo cagA, in grado
di produrre la citotossina vacuolizzante vacA. Tale ceppo è riconosciuto come il più virulento e maggiormente implicato nei danni alla mucosa.
Tuttavia, nella maggior parte delle situazioni cliniche, non viene ritenuta indispensabile la determinazione della virulenza
del ceppo, basandosi la terapia essenzialmente sul rilevamento
della presenza del germe.
Altre metodiche di biologia molecolare applicate su vari materiali (biopsie gastriche, feci, placca batterica dentale), pur dotate di alta sensibilità, non hanno trovato applicazione clinica per il loro costo e complessità.

METODICHE NON INVASIVE:

Tali metodiche hanno avuto sempre maggiore diffusione.
Infatti, negli ultimi anni il crescente numero di patologie riferite alla presenza di HP e la non costante associazione con un danno alla mucosa gastrica, molto spesso modesto o assente, ha indotto a ritenere non giustificabile in termini di costi e di rilevanza clinica
il ricorso ad endoscopie (Maastricht III Consensus report)(13)(14)

Sierologia

Numerosi test sierologici sono stati introdotti per l’identificazione dell’infezione da HP. Attualmente i più usati sono quelli basati su metodica ELISA la cui sensibilità è valutabile intorno all’80%. Va segnalata tuttavia la relativamente ampia zona grigia di negatività (circa 20%) e la difficoltà a distinguere una infezione in corso da una remota, fatto che ne limita l’utilità nel monitoraggio dell’efficacia della terapia eradicante.
I test sierologici conservano tuttavia un ruolo importante nelle situazione in cui gli altri test sia invasivi che non invasivi dimostrino una minor sensibilità.
In particolare l’indagine sierologia è tuttora indicata in
soggetti in trattamento con PPI, con ulcera peptica sanguinante,
con gastrite atrofica o MALT linfoma. La ricerca su siero o su saliva di anticorpi anti HP trova inoltre impiego nella diagnostica in età pediatrica.

Urea Breath Test C13 (UBT)

Questo test, ampiamente usato nella pratica clinica, è di relativa semplicità e con le metodiche più recenti consente l’esecuzione in tempi rapidi.
Infatti la raccolta del campione di aria espirata dopo l’assunzione di urea-C13 può essere limitata ad un solo campione, oltre a
quello di base, dopo 30 minuti.
Ormai innumerevoli studi ne hanno confermato l’alta sensibilità e specificità riportate intorno al 95%.
Poiché il test è dipendente dall’attività ureasica presente
a livello delle prime vie, esso è da una parte influenzato,
in maniera irrilevante, dalla presenza di altri batteri con simile attività metabolica presenti nel cavo orale o nello stomaco, e in maniera assai più importante, dal numero di batteri HP presenti nello stomaco.
Ciò spiega il confermato rilievo di una caduta di sensibilità
di circa il 30 % nei soggetti HP positivi in corso di trattamento con farmaci inibitori di pompa protonica.
In queste circostanze la ri-positivizzazione del test richiede circa 14 giorni di sospensione dal farmaco. In modo analogo la sensibilità cala in altre situazioni in cui la densità del batterio nella mucosa gastrica diminuisce, come nella gastrite atrofica e talora in corso di MALT linfoma. Una possibilità di aumentare la potenza del test consiste nell’introduzione, assieme all’urea marcata, di sodio citrato, che induce un aumento dell’attività ureasica.
Situazioni cliniche che riducono l’utilizzazione del test sono legate principalmente a scarsa collaborazione del paziente (bambini, anziani,
altre situazioni psiconeurologiche)

Ricerca antigene fecale (HpSa)

Il basso costo, la facilità di impiego, l’eseguibilità della raccolta a domicilio, hanno progressivamente diffuso l’impiego di questa metodica. Si basa su metodi di immunoassay policlonale o, più recentemente, monoclonale.
La sua sensibilità e specificità sono solo modestamente inferiori a quella dell’UBT, rispettivamente del 91 e 93% (review di 89 studi). È tuttavia da sottolineare l’importanza di una corretta raccolta e conservazione del campione in quanto la sensibilità del test cala
al 69% se il campione viene tenuto a temperatura ambiente
per 48-72 ore.
Come per l’UBT, la positività per HpSa può essere influenzata da emorragie in corso del tratto gastroenterico, dalla presenza di gastrite atrofica o dall’uso di farmaci inibitori di pompa protonica.
Le limitazioni di impiego del test, oltre a quanto appena citato, possono risiedere in tutte quelle circostanze che rendano difficoltosa la raccolta del campione di feci.

OBIETTIVO:

Scopo di questo lavoro è verificare l’attendibilità delle attuali metodiche diagnostiche comunemente utilizzate per la ricerca dell’HP vs un’indagine sierologica mediante Western Blotting.

METODO:
Sono stati analizzati 41 pazienti, 10 di sesso maschile e 31 di sesso femminile, di età compresa tra i 21 e gli 86 anni, venuti alla nostra osservazione per disturbi dispeptici, già indagati precedentemente con una o più EGDS, HpSa e UBT, risultati H.Pylori negativi, in cura con IPP e/o antiacidi e 14 pazienti, 5 di sesso maschile e 9 di sesso femminile, di età compresa tra i 31 e i 76 anni, con un precedente test positivo all’HP, a seguito del quale era stata prescritta una terapia eradicante, con conferma successiva di negativizzazione dell’HP mediante UBT.
(Tab.1)

EGDS BT Ag feci Totale
H.Py - 38 2 3 43
H.Py + 11 1 0 12
Totale 49 3 3 55
Tab.1: Positività per Helicobacter Pylori con le diverse metodiche di ricerca


Data la grande variabilità soggettiva dei sintomi accusati, per la scelta del gruppo da esaminare è stata presa in considerazione la triade gastralgia/reflusso GE /pirosi gastrica che accomunava tutti i pazienti studiati. A tutti i pazienti è stato ricercato l’HP tramite metodica Western Blotting su siero.


RISULTATI:

Il 63% dei pazienti che ai test di routine erano stati dichiarati negativi all’HP, risultarono positivi alle citotossine CagA e/o VacA IgG, 14 dei quali positivi anche per le IgA.
15 pazienti risultarono positivi alla UreA, subunità ureasica leggera di 29kD altamente specifica; 5 pazienti risultarono negativi all’HP.

Dei 18 pazienti che, malgrado la terapia eradicante, manifestavano ancora la triade sintomatologica suddetta, 16 (90%) risultarono ancora positivi alle citotossine CagA e/o VacA, 7 dei quali anche alle IgA; 1 paziente presentava l’UreA; 1 paziente era negativo all’H.P. (Tab.2-3)



Western Blot per Helycobacter Pylori Ab IgG


H.Py + H.Py -
CagA 11 27
VacA 6 15
Ureasi 8 15
Altro 5 18

Tab 2: Ab specifici per IgG Helicobacter Pylori nei gruppi con pregressa positività o negatività all’ Helicobacter Pylori (valori assoluti)

H.Py + H.Py -
CagA 92% 63%
VacA 50% 35%
Ureasi 67% 35%
Altro 42% 42%

Tab 3: Ab specifici per IgG Helicobacter Pylori nei gruppi con pregressa identificazione o assenza di Helicobacter Pylori (valori percentuali)

DISCUSSIONE:

Le attuali linee guida per la ricerca dell’HP, l’eradicazione e i test di conferma della stessa, si basano ancora sulle indicazioni del “Maastricht 2-2000 Consensus Report”(16), che prevede l’UBT e l’HpSa come indagini diagnostiche preferenziali, ed eventualmente l’EGDS laddove se ne riscontrino le indicazioni, ad esempio in caso di apparente refrattarietà alla terapia eradicante.
Eppure nessuna di queste tecniche, a tutt’oggi, si rivela essere abbastanza specifica per ottenere, in tempo reale, una diagnosi di infezione da H. Pylori.(15)



L’istologia comporta un’alta probabilità di mancata diagnosi, per la modalità di colonizzazione della mucosa gastrica da parte del batterio, “a macchia di leopardo”, che ne limita l’attendibilità. E’ perciò un’esame che trova il suo utilizzo specifico solo come analisi dello stato della mucosa.
l’Urea Breath Test e la biopsia in corso di EGDS si basano sull’attività ureasica del batterio, assente nei ceppi di HP produttori di citotossine.
Esistono, infatti, due fenotipi di H. Pylori:
Tipo I: CagA+/VacA+, in grado di produrre la citotossina VacA e la proteina CagA
Tipo II: CagA-/VacA-, incapace di esprimere le due proteine.
La proteina di superficie di circa 130 kDa, espressa dal Gene CagA, presente nel 60% dei ceppi, è da tempo considerata tra i principali immunodominanti del batterio (20); gli anticorpi anti citotossina vacuolizzante, VacA, di 95kD, sono presenti nel 100% dei sieri di pazienti infetti da HP che manifestano l'ulcera peptica e nel 62% dei pazienti sofferenti di gastrite; le due citotossine sono associate a comparsa di ulcera duodenale, gastrite cronica atrofica, adenocarcinoma gastrico e stimolano la produzione di IL8, importante fattore chemiotattico per i linfociti impegnati nell'evoluzione del processo infiammatorio.(21)
Quindi la ricerca sierologica dell’HP, tramite metodica ELISA, che non riesce a testare pesi molecolari superiori a 60kD, l’UBT e la biopsia in corso di EGDS risulteranno falsamente negativi proprio nei casi di maggior patogenicità del batterio


Ne consegue che i pazienti maggiormente a rischio di sviluppare complicanze importanti dell’infezione, che non si limitano all’ambito gastro-enterico, come abbiamo già sottolineato precedentemente, ma prevedono anche patologie interessanti altri organi, quali tiroide, pancreas, vie biliari etc.., non ricevano terapie adeguate, ma vengano classificati spesso come “funzionali” e, come tali, trattati con blandi farmaci sintomatici, quand’anche con terapie di supporto psicologico.


Nel campione analizzato, infatti, la ricerca tramite Western Blot ha evidenziato la presenza delle due citotossine in 13 su 18 pazienti con gastrite ulcero/erosiva e in 20 pazienti su 26 portatori di Gastro-Duodenite Cronica. (Tab.8)
Il mancato riconoscimento dell’infezione porta, in ultima analisi, ad una cronicizzazione della patologia, con grave disagio del paziente e con tutte le deleterie conseguenze derivanti che gravano, anche in termini economici, sul SSN.


CONCLUSIONI:

Il nostro studio dimostra come la ricerca sierologica dell’H. Pylori tramite metodica Western Blotting sia l’unico esame veramente sensibile, altamente specifico, per nulla invasivo, potendosi applicare anche a pazienti in età infantile, e relativamente poco costoso confrontato con le altre metodiche analizzate.
Risulta incomprensibile come questa metodica d’indagine non venga mai presa in considerazione, nella maggior parte dei casi non è neppure conosciuta dai medici del nostro SSN, pur essendo, da una revisione accurata della letteratura internazionale, la metodica maggiormente riferita nei più recenti lavori pubblicati in merito.(22..33)


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